考马斯亮蓝染色详细步骤（如何通过考马斯亮蓝染色法测定植物可溶性蛋白）

可溶性蛋白指可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白。通常在植物生理、微生物、食品加工等实验中作为重要指标。如可溶性蛋白是植物抗旱性的重要指标之一。今天栢晖生物就给大家分享一下如何通过考马斯亮蓝染色法测定植物中的可溶性蛋白：

“1试剂

所有试剂除注明者外，均为分析纯。

1.1 考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。

1.2 90% 乙醇

1.3 100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA定容至100 ml即为100 g/ml。或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。

1.4 0.05 mol/LpH7.8磷酸配制：

A母液，0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO4·12H2O (分子量358.14)35.85 g，用蒸馏水定容至500 ml。

B母液，0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O (分子量156.01)1.5601 g，用蒸馏水定容到50 ml。

1.5 0.05M pH7.8磷酸：分别取A母液228.75ml，B母液21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

“2主要仪器

万分之一分析天平、紫外可见分光光度计、离心机

“3试样的制备

取风干的实验室待测样品充分混匀后，籽粒全部通过 0.25mm（秸秆通过 0.5mm）孔径筛，装入样品瓶备用。

“4分析步骤

4.1 试样溶液制备

样品提取：取鲜样0.2—0.5g，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min离心10min，上清液备用。

4.2 标准曲线绘制

取6支具塞试管，依次加入标液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，然后用蒸馏水补充至1ml，再向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

4.3 样品的测定

吸取样品提取液1.0ml（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min待反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。

“5结果计算

式中：

C—查标准曲线值，g；

Vt—提取液总体积，ml；

WF—样品鲜重，g；

Vs—测定时加样量，ml

所得结果应保留小数点后三位